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想做反转录,然后扩增目的条带,不知道RNA提得可以吗?

2016-10-28技术资料

我想做反转录,然后扩增目的条带,不知道RNA提得可以吗?第一个泳道不知道为什么跟其他的不一样?

 
不知你提取的是什么东东的RNA?
我提过细菌的total RNA。从lz的电泳图来看,质量不好。RIN值太低,表明降解严重。
 

提取的大肠杆菌total RNA,可以用来做转录组分析的。大条带应该是小条带亮度的两倍最好,最差也得亮度差不多,对应的数量差不多。

提的就是细菌的total RNA,没办法,实验室没做过RNA,所以条件不好,这个电泳没加变性剂
 
其实提取RNA的条件没那么苛刻,在普通的通风橱里就可以操作,外源RNase的污染比较好消除,关键是破壁时的内源降解。如果用trizol法就必须考虑trizol的量。
另外,相同的方法提取不同细菌的RNA效果也不一样。比如霍乱用trizol法提取效果极差,而沙门菌提取效果就较好;所以霍乱菌最好是用试剂盒过柱子提取,然后浓缩。我提取的是大肠杆菌,摸索了好几种方法,最后确定也是qiagen 的kit提取,然后浓缩。
另外,有一种可以喷的液体,叫做RNase抑制剂,用于消除表面RNase的污染,在客观条件不是很好的时候很有效。
最后祝lz实验顺利,好运啊!
 

你的样品可能有基因组污染,跑个MOPS电泳看看吧,还可以看看纯度指标,检测下260与280的比值。

 
再请教个问题,细菌RNA做反转录时,引物怎么选择,是选随机引物吗
 
可以用随机引物将RNA翻转成cDNA;也可以用特异引物直接翻转特异的片段。

 
关于你提的RNA的质量:
 
1.顶上的亮带是基因组DNA。如果是Trizol法提的,那就可能是抽提之后取上清时取得太多,吸到了中间相。以后这一步不用贪多的。
如果是检测表达量差异,那么基因组DNA混在cDNA里面,会干扰结果。如此多的基因组DNA污染,不能拿来定量。
所幸,你的目的只是拿来扩增目的条带,那这个没关系,你的RNA可以用:P
 
2.RNA量质量可以从中间两条rRNA的带看出来,你这两条带都有点拖尾,RNA有部分降解,第一个泳道最严重。
 
3.第一个泳道出现弥散状,中间两条rRNA的亮带都看不到,是很典型的RNA降解。
 
4.关于两条rRNA带亮度的差异,两倍是理论值,实际上往往不是这样,不用强求啦。

关于反转录引物的选择:

反转录可分为两种,一种是反转录出总的cDNA,另一种是只反转录你所需的目的基因的cDNA。

1.反转录出总的cDNA:有两种通用引物,一种是随机寡肽,它可以结合到随机位点,并且它的5‘端和3’端都有羟基,都可以介导反转录;另一种是Oligo dT,可以和mRNA的Poly A尾巴结合,但不能介导其他RNA的反转录。Takara的试剂盒同时提供两种引物,并建议两种引物一起用。我觉得如果都有的话,最好一起用。
 
2.反转录出目的基因的cDNA:这个只能设计特异的引物了。跟PCR引物设计类似。

扩增目的条带的话,如果有基因组DNA的扩增,那大小会和cDNA扩增产物不一样的,后续可以通过胶回收得到想要的产物。当然如果内含子很小,可能在胶上看不出来。
 
我提的是细菌RNA,没有内含子吧
 
那其实可以直接用基因组DNA扩增目的片段呀,为什么要提RNA再反转录呢?
 
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