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定量PCR读取荧光值的步骤需要保持多长时间?

2016-09-18技术资料

最近做定量PCR遇到了点问题,仪器是ABI7300,在延伸步骤读取荧光值会有非特征峰,所以想在后面加一步高温步骤(约80-85度)读取荧光值,想问一下通常这一步需要保持多长时间?

我觉得按照你实验的步骤设计吗,30s就行啊,或者短一点,15s左右,这一步只是读数据,关键还是你设计的温度,从溶解曲线可以看出你温度越高,值就越小这是一定的,所以温度是很重要的。实验顺利啊

这样是不行的哦。有非特异峰就代表有非特异扩增,如果你是两步法(退火、延伸用同一个温度),可以改为传统的三步法以增加特异性。也可以尝试提高退火温度。
如果你用的荧光染料是sybr green,只能在延伸结束时检测荧光信号,额外增加一个专门检测荧光的步骤是不可行的哦。
 
有非特异峰值还有可能是管子的问题哦 我们经常遇到的 有些公司的96孔板会有非特异性扩增 换成好些的8-strips tube就没啥问题了
 
我用的确实是SYBR green, 三步法的结果不太理想,标线斜率-2.22...相当于极其高的扩增效率,遂改成两步法在实验,我们周围有加一步专门检测荧光的步骤,效果还不错,呵呵,所以才在此询问一下各位。
 
我用的是ABI的8-strips管子,绝对没有问题

我觉得按照你实验的步骤设计吗,30s就行啊,或者短一点,15s左右,这一步只是读数据,关键还是你设计的温度,从溶解曲线可以看出你温度越高,值就越小这是一定的,所以温度是很重要的。实验顺利啊
谢谢您的回复! "从溶解曲线可以看出你温度越高,值就越小这是一定的" 这句话是什么意思? 您说得是保持时间还是温度设定值?

呵呵,不好意思,孤陋寡闻了,之前没听说过有这么做的
刚看了下天根的资料,有提到如果有引物二聚体怎么处理,其中一个方法是“在延伸反应结束之后加上一个温度(高于引物二聚体解链温度而低于目的片段解链温度)延伸数秒。”我没做过,引号内是他们原文哈。
下面是个人看法,欢迎各位指正:
我想这跟你打算用的方法应该是一个意思吧。原理我想应该是这样:Sybr Green只能检测双链,所以提高温度让非特异结合解链而保持目的片段不解链,这时候检测荧光信号的话就没有非特异产物的信号了。具体取几度,应该可以参照熔解曲线,取特异产物的峰和非特异产物的峰中间的温度就可以了。至于时间,他们说几秒钟,个人认为是合理的:很多PCR程序的变性时间只需要20秒左右,非特异产物结合的强度肯定不及模板(因为远远比模板短),模板解链需要的时间都这么短,要搞定非特异产物几秒钟应该足矣。
如果还是不行,建议还是换引物吧。
 

72℃估计还不够,这只是普通延伸的温度啊。我自己做的荧光定量,目的片段在熔解曲线上的峰对应的温度一般在80~85℃之间,我觉得这个温度可以在80度上下。我还是上一个回复那个意思:具体取几度,应该可以参照熔解曲线,取特异产物的峰和非特异产物的峰中间的温度就可以了。
或者你上个熔解曲线图,我们一起讨论下


72℃估计还不够,这只是普通延伸的温度啊。我自己做的荧光定量,目的片段在熔解曲线上的峰对应的温度一般在80~85℃之间,我觉得这个温度可以在80度上下。我还是上一个回复那个意思:具体取几度,应该可以参照熔解 ...
斑竹您好,这是我用三步法扩增时得到的溶解曲线,设置在72度读数,不过后面有个小峰,我不知道会不会影响最后的读数,我总共做了几十个样本,只有这四个(平行样)后面有小峰。。。能否给点意见?是否需要重新做一下?
 

后面的峰肯定不是引物二聚体了,解链温度这么高。可能是非特异扩增,你可以跑个电泳看看有没有条带。个人意见,仅供参考哈

学术问题

 
可以具体发一个程序图吗?是在每一个循环后加一个79度 5s 吗?比如我用的这个程序怎么改?

 
 
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